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細(xì)胞色素C的制備及含量、活力測(cè)定分析

更新時(shí)間:2016-11-22      點(diǎn)擊次數(shù):2111
    實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?div>  1、通過細(xì)胞色素C的制備,了解制備蛋白質(zhì)制品的一般原理和步驟
  2、掌握制備細(xì)胞色素C的操作技術(shù)及含量的測(cè)定方法
  實(shí)驗(yàn)原理:
  細(xì)胞色素是一類含有鐵啉基團(tuán)的電子傳遞蛋白,只存在于需氧細(xì)胞中。細(xì)胞色素在線粒體內(nèi)膜上起傳遞電子的作用。細(xì)胞色素C是細(xì)胞色素一種。它在線粒體呼吸鏈上位于細(xì)胞色素B和細(xì)胞色素氧化酶之間,是呼吸鏈的一個(gè)重要組成部分。每分子細(xì)胞色素C含有一個(gè)血紅素和一條多肽鏈?,F(xiàn)已從許多來源獲得細(xì)胞色素C結(jié)晶,并已對(duì)100多種細(xì)胞色素C蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了測(cè)定。
  結(jié)果表明,細(xì)胞色素C的氨基酸殘基的數(shù)目在103~113之間;不同來源細(xì)胞色素C的的氨基酸殘基的順序及含量都有一定的差異。細(xì)胞色素C中賴氨酸含量較高,等電點(diǎn)為10.7,含鐵量為0.38%~0.43%,Mr為12000~13000,豬心細(xì)胞色素C分子量12200。細(xì)胞色素C是一種穩(wěn)定的可溶性蛋白,它易溶于水及酸性溶液,故常用酸性水提取。
  細(xì)胞色素C分為氧化型和還原型兩種,氧化型水溶液呈深紅色,還原型水溶液呈桃紅色。細(xì)胞色素C對(duì)熱比較穩(wěn)定,不易變性。pH 7.2~10.2,100℃加熱3分鐘,細(xì)胞色素C氧化型和還原型變性程度均為18%~28%,若增加加熱時(shí)間,氧化型的不可逆變性程度比還原型的為高。細(xì)胞色素C對(duì)酸堿也較穩(wěn)定,可抵抗0 .3mol/L氫氧化鉀溶液的長(zhǎng)時(shí)間處理。一般都將細(xì)胞色素C制成還原型的,因?yàn)楸容^穩(wěn)定并易于保存。
  細(xì)胞色素C試劑與器材:
  絞肉機(jī)、電磁攪拌器、離心機(jī)、分光光度計(jì)、玻璃柱、下口瓶、燒杯等。
  操作方法:
  材料處理-提取-中和-吸附-洗脫-鹽析-沉淀-透析-測(cè)定
  細(xì)胞色素C關(guān)鍵步驟與注意事項(xiàng):
  1、吸附前必須把人造沸石處理好,裝柱時(shí)避免柱內(nèi)出現(xiàn)氣泡,沿柱壁緩緩流入柱內(nèi)。
  2、洗脫時(shí)洗脫液一旦變白,立刻停止收集。洗脫完畢人造沸石可再生使用。
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